CLOSTRIDIUM DIFFICILE

ÉTUDE BACTÉRIOLOGIQUE ET DIAGNOSTIC


SOMMAIRE

I – OBJECTIFS
II – ARGUMENTATION 
III – INTRODUCTION 
IV – HISTORIQUE
V – HABITAT 
VI – ÉTUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE 
VII – LES PRINCIPAUX MÉCANISMES DE TRANSMISSION
VIII – PHYSIOPATHOLOGIE  
IX – POUVOIR PATHOGÈNE NATUREL (P.P.N) 
X – ÉTUDE BACTÉRIOLOGIQUE
XI – DÉMARCHE DU DIAGNOSTIC
XII – ANTIBIOGRAMME ET ANTIBIOTHÉRAPIE
XIII – STRATÉGIES THÉRAPEUTIQUES
XIV – PRÉVENTION DES INFECTIONS NOSOCOMIALES


Pr. SALIM DJELOUAT
Professor of Bio-Clinical Medical
Expert certified


Synonyme :  Bacillus difficilis

Abréviation  : Clostridium difficile



IOBJECTIFS

Ce document a pour but de répondre à des interrogations par la présentation de cette bactérie « opportuniste », mais responsables d’épidémies de diarrhées, le plu souvent mortelles.

IIARGUMENTATION 

De très nombreuses épidémies de diarrhées associées à Clostridium difficiles ont été récemment décrites et leurs prises en charge très mal faites.

IIIINTRODUCTION 

Clostridium difficile est la bactérie la plus fréquemment retrouvée dans les diarrhées associées aux traitements de longues périodes par les antibiotiques.
L’administration d’antibiotiques surtout à large spectre, entraîne des changements dans la flore intestinale, ce qui va favoriser la colonisation de ce dernier par Clostridium Difficile.
Clostridium difficile est un bacille à Gram (+), anaérobie strict et sporulé.
C’est un entéropathogène responsables d’inflammations intestinales chez les malades hospitalisés en longue durée.
Clostridium difficile est le principal agent responsable de diarrhées post-antibiotiques et il est souvent impliqué dans les diarrhées nosocomiales et plus particulièrement celles de l’adulte.

coloration-de-gram-clostridium-difficile
C. Difficile – Gram positif

IVHISTORIQUE

La colite pseudomembraneuse (C.P.M), fut décrite pour la première fois par Finney en 1893 au cours d’une chirurgie digestive.

Elle fut ré décrite une deuxième fois vers les années 1974.

En 1935, Hall et O’ Toole décrivent la bactérie dans les selles de nouveaux nés et lui donnèrent le nom de bacillus difficile (qui vient du Latin difficilis), en raison des difficultés qu’ils éprouvèrent à la cultiver et à l’isoler.

En 1940, Snyder isola Clostridium difficile chez des nourrissons âgés de 10 semaines à 1 an.

En 1960, Mc Bee, isola Clostridium difficile d’un contenu intestinal.

En 1962, Smith et king, signalèrent sa présence dans les infections humaines.

L’introduction de la clindamycine (famille des lincosamides) en thérapeutique entraîne une flambée d’observations de C.P.M et ce suite à une perturbation de la flore intestinale qui va permettre aux souches toxinogènes de se multiplier et de produire leurs toxines.

Ceux-sont Larson (Angleterre) et John Bartlett (USA) qui démontrent l’existence d’une activité cytotoxique dans les selles de patients atteints de C.P.M post-antibiotiques.

Enfin en 1984 sont caractérisées la toxine A (entérotoxine) et la toxine B (cytotoxine).


VHABITAT 

1Chez l’adulte
Portage digestif et asymptomatique est estimé actuellement vers les 5 à 7% de la population adulte. En cas de traitement antibiotiques prolongé ou lors d’un séjour dans une unité de soins, le portage peut atteindre 20 à 25% des sujets.
2 Chez les enfants de moins de 2 ans
Le taux de portage reste très élevé et peut atteindre 50 à 70% des cas.
3Chez les enfants de plus de 2 ans
La fréquence de Clostridium difficile est presque comparable à celle de l’adulte.
4Dans la nature
Clostridium difficile est retrouvé dans le milieu extérieur : sol, l’eau (de rivières, lacs, eau de mer, eaux de piscine…).
Il est aussi rencontré dans presque tous les végétaux crus.
On le trouve aussi dans les milieux hospitaliers, les crèches et les foyers pour les personnes âgées.
5Chez les animaux
C. difficile est rencontrés chez les bovins, ovins, porcs, volaille, les oiseaux….


VIÉTUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE 

Cet agent est majoritairement impliqué dans les diarrhées nosocomiales de l’adulte. Plusieurs dizaines d’épidémies ont été décrites aux USA et en Europe, d’où une surveillance en milieu hospitalier.
Un clone particulier appelé P.C.R ribotype 027 de cette bactérie, a été identifié et associé à une morbidité et une mortalité très élevées.
Cette bactérie est extrêmement contagieuse, en raison de la rémanence de spores sur les surfaces   inertes ; elle nécessite des mesures drastiques d’isolement des patients, d’hygiène et de désinfection.
C. difficile est une bactérie assez résistante aux antibiotiques.

Les principaux facteurs de risques sont :
Forte contamination de l’environnement
Promiscuité des patients
Fréquence des soins
Mauvaise sélection des antibiotiques et longues durées de prescription
Age avancé et supérieur à 65 ans
Modification de l’écosystème digestif 

Note
Les personnes en bonne santé ne sont pas affectées par C. difficile.


VIILES PRINCIPAUX MÉCANISMES DE TRANSMISSION

1En milieu extra-hospitalier
La bactérie est présente dans les selles d’où une transmission féco-orale.
La résistance de la spore de Clostridium difficile, va lui permettre de persister longtemps dans le milieu extérieur et à l’acidité gastrique.
L’antibiothérapie, un âge avancé et l’état du patient, sont des facteurs influents de l’infection.

2En milieu hospitalier
La transmission se fait par contact avec des surfaces contaminées par les selles ou par certains objets de l’environnement tels que par exemple : chasse d’eau, robinets, poignées de porte… La contamination interhumaine (le personnel et les visiteurs), se fait par des mains contaminées.


VIIIPHYSIOPATHOLOGIE  

La prescription depuis plusieurs jours d’antibiotiques à large spectre (Aminopénicillines, Céphalosporines) ou à spectre étroit (Clindamycine), entraîne au sein de la flore digestive, l’émergence et la sélection de Clostridium difficile qui va produire des toxines et des enzymes.
Clostridium difficile possède de nombreux facteurs de pathogénicité :
1En milieu extra-hospitalier –
Il existe trois principaux facteurs de virulence de C. difficile :
1.1 – La toxine A est nommée entérotoxine :
Car elle fortement entérotoxique dans le modèle de l’anse ligaturée de lapin ; elle possède également une activité cytotoxique.
Elle induit une inflammation importante, avec une infiltration massive des polynucléaires et des cellules mononuclées.
Cette inflammation se complique en nécrose de l’épithélium intestinal avec une accumulation de fluide.
1.2 – La toxine B ou cytotoxine :
Elle est mille fois plus puissante que la toxine A et s’attaque directement aux cellules de l’épithélium.
Elle induit un effet cytopathogène avec augmentation de la perméabilité de la muqueuse intestinale.
Ces deux toxines agissent en synergie.
1.3 – La toxine ADP-ribosyltransfèrase :
Elle est produite par certaines souches.
Cette toxine participe au pouvoir pathogène par dépolymérisation de l’actine.
Note
Les souches non toxinogènes sont considérées comme non virulentes.

2Autres facteurs de virulence –
2.1 – Enzymes protéolytiques (Hyaluronidase, Gélatinase, Collagénase…) : ces enzymes facilitent le maintien des bactéries dans le tube digestif.
2.2 – Mobilité : par des flagelles
2.3 – Adhésion : par pili fimbriae (leur nature à ce jour n’est pas connue avec certitude).
2.4 – Capsule (présence de polysaccharides de surface), joue un rôle dans la résistance à la phagocytose.


IXPOUVOIR PATHOGÈNE NATUREL (P.P.N) 

Clostridium difficile est responsable de 15 à 25% des diarrhées post – antibiotiques et de colites pseudomembraneuses
La colite pseudomembraneuse est la forme la plus sévère de la maladie.

colonoscopy-reveals-pseudomembranous-plaques-in-the-colon-of-a-patient-with-clostridium-difficile-infection-a-b-and-c
C. Difficile – Gram positif

Plus de 95% des C.P.M présentent les signes suivants :

Diarrhées aqueuses
Fièvre
Déshydratation
Perte de l’appétit
Douleurs et crampes abdominales
Nausées
Les selles sont rarement hémorragiques
Important 
À l’examen cytologique des selles : on note une hyperleucocytose

Les complications sont graves:
Perforation
Péritonite
Mégacôlon toxique pouvant entraîner le décès du malade (dans presque les 40% des cas)

Observation
Les signes cliniques régressent dans 25% des cas après l’arrêt de l’antibiotique responsable. Les rechutes sont fréquentes (20%) et surviennent dans les 2 mois suivant l’épisode.

Note
Chez les nouveau-nés et chez les jeunes enfants nourris au lait maternel, les infections à C. difficile sont très rares et ce malgré une très forte concentration en toxines dans leurs selles.


XÉTUDE BACTÉRIOLOGIQUE

1Caractères morphologiques
Clostridium difficile est un bacille à extrémité légèrement renflée et à Gram positif, mesurant 0,7 à 2 µm de diamètre et ayant une longueur de 3 à 16 µm de longueur.
Il peut se présenter soit groupés ou en courtes chaînettes (4, 6 ou 8 cellules).
Mobilité (+) par ciliature péritriche
Capsule (+) (S-layer)
Spore (+), subterminales, rarement terminales est à coloration Gram négatif.

2Caractères culturaux
Clostridium difficile est un germe anaérobie strict
La température optimale de croissance est de 37°C, mais accepte des variations de températures de 25 et à 45 °C.

2.1 – Sur gélose au sang –

Après 24 heures d’incubation –cdifficilis-sur-gelose-au-sang
Les colonies sont circulaires ou à contour irrégulier, elles sont plates ou légèrement convexes, opaques, blanchâtres ou grisâtres et leur diamètre est compris entre 2 et 5 mm. A noter qu’il y a une absence d’hémolyses
Après 48 heures d’incubation :
Les colonies présentent une fluorescence vert pâle.

 

2.2 – En bouillon PYG
La croissance se traduit par un trouble
En 5 jours, il y a apparition d’un sédiment et d’une acidification du milieu (pH 5 à 5,5)

3Caractères biochimiques –
Catalase (-)
Glucose (+)
Mannitol (+)
Gélatinase (+)
Esculine (+)
Lactose ()
Saccharose ()
Inuline ()
Nitrate réductase ()
Indole ()

esculine-positive
Milieu à l’Esculine 

XIDÉMARCHE DU DIAGNOSTIC

Le diagnostic bactériologique est un examen inhabituel et qui est demandé dans un contexte clinique particulier.

1La recherche de Clostridium difficile se fait chez 

Patients diarrhéiques
Patients sous antibiothérapie « 4 semaines », (la durée de l’antibiothérapie majore le risque) ou hospitalisation récente
Patients sous chimiothérapie
Prise de laxatifs ou de stimulants gastro-intestinaux
Tous les facteurs modifiant l’écosystème ou la motilité intestinale


2La démarche du diagnostic

Repose en priorité sur la recherche des toxines, parallèlement à la culture de Clostridium difficile.

2.1Prélèvement 

C. difficile est recherché à partir des selles liquides en évitant l’écouvillonnage rectal. in1
La recherche des toxines doit être effectuée à partir de selles liquides ou de liquides intestinaux (examen endoscopique).
Si l’examen est différé, les échantillons doivent être conservés à 4° C.
La conservation à température ambiante ou la congélation à – 80°C diminuent notablement l’activité des cytotoxines.
La quantité de selles à prélever est de 3 ml minimum à 5 ml.

À noter que Clostridium difficile peut être aussi isolé lors de certaines :
Bactériémies
Péritonites
D’infections de plaies chirurgicales
D’abcès du cerveau
D’ostéomyélites…

2.2Mise en évidence des toxines :

La grande majorité des souches produisent simultanément les toxines A et B.
Leur mise en évidence directement à partir des selles est un excellent marqueur de la présence d’une souche toxinogène de C. difficile.

Il existe plusieurs techniques de recherches, les principales sont :

2.2.1La méthode par la recherche de l’effet cytopathogéne (E. CP) de la toxine B par culture cellulaire (méthode de référence) : différentes lignées cellulaires sont utilisables : MRC 5, Véro, CHO, HeP2.
Cette méthode présente une excellente sensibilité (ordre du pico gramme) mais se heurte à l’absence de standardisation et nécessite une infrastructure lourde, le délai de réponse est de plusieurs jours.
Il existe actuellement un test automatisé de détection des toxines A et B de Clostridium difficile, lancé en juillet 2007 par les laboratoires BioMérieux et baptisé VIDAS® C. difficile Toxin A&B.
Ce test, utilise une nouvelle solution assez rapide et performante.
Ces principaux avantages sont :
Rapidité dans les résultats : en 75 minutes seulement (contre 24 à 48 heures pour la méthode de référence).
Prise des décisions thérapeutiques et d’isolement des patients plus rapides

2.2.2Tests immuno-enzymatiques, surtout tests ÉLISA ou tests unitaires, immuno-enzymatiques ou immuno-chromatographiques :
Ils détectent soit la toxine A seule, soit les toxines A et B au moyen d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux.
Les tests unitaires rapides permettent de rendre un résultat en moins de 30 minutes.
La spécificité des méthodes ÉLISA est bonne (>95%) avec une sensibilité qui varie selon les études (60-90%).
Ils existent cependant de faux négatifs  

2.2.3Techniques de biologie moléculaire ou P.C.R
Servent pour détecter les toxines A et/ou B est encore d’application limitée à cause de l’extraction des selles et de l’éventuelle présence d’inhibiteurs de la Taq polymérase.
De nouveaux kits d’extraction et le développement de la P.C.R en temps réel devraient rendre ces nouvelles approches intéressantes dans un avenir proche.


3La culture et la mise en évidence de la bactérie dans les selles :

Il existe plusieurs techniques –

3.1Diagnostic rapide par recherche d’antigène dans les selles
Il s’agit du glutamate déshydrogénase qui peut être mise en évidence par agglutination (test latex) ou par méthode immuno-enzymatique, (Le test « Triage® C. difficile Panel » -Biosite Diagnositcs Inc.).
La spécificité est bonne mais ces tests ne représentent que des méthodes de dépistage puisqu’ils ne préjugent pas du caractère toxinogène de la souche.

3.2 Isolement de Clostridium difficile par culture
L’examen microscopique des selles est peu informatif. jar2
La culture est effectuée dans des conditions d’anaérobiose stricte (sachet individuel + jarre), sur milieux sélectifs comme le milieu TCCA :
Gélose cœur cervelle additionnée de 5% de sang de cheval
0,1% de taurocholate (sert comme substance enrichissante permettant la germination des spores, ce qui fait augmenter la sensibilité de la culture).
250 mg/l de cyclosérine (inhibiteur)
10 mg/l de céfoxitine (inhibiteur)
Ou
Le milieu de Wilkins-Chalgren
Après 48 h d’incubation en anaérobiose à 37°C, les colonies sont faciles à repérer, elles présententcolo1les caractéristiques suivantes :
Colonies circulaires à bords irréguliers (3 – 5 mm), non hémolytiques
Colonies présentant un aspect de verre fritté à la loupe binoculaire
Odeur caractéristique de crottin de cheval (libération de crésol)
Colonies fluorescentes sous UV (mais dépend du milieu utilisé)   

 

3.3Autres milieux de culture spécifiques pour Clostridium difficile :

3.3.1Milieux sélectifs prêts à l’emploi 
Milieu CCFA (cycloserine-cefoxitin-fructose agar)
Gélose Clostridium difficile(BioMérieux)
Clostridium Difficile Selective Agar (CDSA)  
3.3.2 – Milieux non sélectifs prêts à l’emploi 
Gélose Schaedler + 5% de sang de mouton (BioMérieux)
Gélose Columbia + 5% sang de mouton (BioMérieux)
3.3.3Milieux en poudre 
Base Columbia (BioMérieux), ajouté 5% de solution de jaune d’œuf (Becton-Dickinson)
Milieu pour Clostridium difficile + suppléments (Oxoid) 
3.3.4Milieux de transport 
Gélose profonde (type VF)
Boite au sang sous sachet de type Anaerogen Compact (Oxoid), Anaerocult P (Merck)
Quel que soit le milieu utilisé, il est recommandé d’ajouter de la cyclosérine à raison de 200 µg /mL. Incuber en anaérobiose 24 à 48 h.  


4L’identification

Elle peut être réalisée par utilisation de galeries biochimiques rapid  ID 32A, API 20A …,  mais la plupart des caractères de cette bactérie sont négatifs.
Elle se fait aussi par le typage des souches  et par des méthodes génotypiques :
P.C.R-ribotypage
Toxinotypie
Marqueurs de différenciation des souches isolées


5Diagnostic radiologique par endoscopie :     

Associée ou non à la tomographie axiale.
Il permettra de visualiser certains aspects caractéristiques :
Une infiltration inflammatoire intense de la muqueuse du côlon et du rectum
et
La présence de fausses membranes fibrineuses adhérentes à la muqueuse.



XIIANTIBIOGRAMME ET ANTIBIOTHÉRAPIE

L’antibiogramme ne présente qu’un intérêt taxonomique (résistance naturelle à certaines ß-Lactamines dont la céfoxitine ou FOX).   
1Habituellement sensible
Amoxicilline
Pipéracilline
Imipénème
Glycopeptides
Imidazolés
Erythromycine (plusieurs souches sont devenues résistantes)
Tétracycline
Rifampicine
Chloramphénicol
2Résistance naturelle
Céphalosporines
Céfoxitine
Moxalactam
Fluoroquinolones
3Résistance acquise
Clindamycine (CLI) est relativement fréquente.  

ab1


XIIISTRATÉGIES THÉRAPEUTIQUES

1Le traitement est simple 

1.1Arrêt de l’antibiothérapie si possible
1.2Traitements spécifiques (voir tableau)
1.3prévention des rechutes
1.4Certaines études ont montré que l’association d’agents probiotiques (Saccharomyces boulardii ou Lactobacillus GG) aux traitements antibiotiques usuels, diminuerait le taux de récurrence.

2Stratégies 

Le traitement antibiotique est indiqué que dans les situations suivantes :
Diarrhée sévère ou signes de colite (ex. fièvre, leucocytose, signes de colite au scanner ou à l’endoscopie).
Persistance de la diarrhée malgré l’arrêt de l’antibiotique en cause.
Nécessité de poursuivre l’antibiotique responsable en raison de l’infection sous-jacente.
La Vancomycine et le Métronidazole sont les molécules les plus fréquemment prescrites  


XIVPRÉVENTION DES INFECTIONS NOSOCOMIALES

C. difficile est reconnu comme le principal agent de diarrhées nosocomiales chez l’adulte.
La prévention de la transmission repose sur l’isolement technique et géographique des patients symptomatiques.
Le lavage des mains avec un savon antiseptique (type chlorhexidine actif sur les spores) et port de gants sont des mesures essentielles.
L’éradication des réservoirs inertes est difficile du fait de la persistance des spores et impose une désinfection quotidienne.

lavage-des-mains


https://www.cdc.gov/hai/organisms/cdiff/cdiff_infect.html                                                  http://www.cdd.com.au/pages/disease_info/clostridium_difficle.html http://www.gikids.org/content/113/en/clostridium-difficile/francias  


Pr. SALIM DJELOUAT
Professor of Bio-Clinical Medical
Expert certified Author and scientist Author
Webmaster, blogger  

 

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